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Le BET au laboratoire

Recommandations de manipulation et d’élimination

Utilisation de bromure d'éthudium (OU BET)

Bien que le bromure d’éthidium (BET) soit un outil efficace, ses propriétés dangereuses exigent des procédures adaptées lors de sa manipulation et son élimination. Les conseils suivants ne sont donnés qu’à titre de recommandations. La prévention du risque chimique lié à la manipulation du BET doit suivre les règles générales relatives aux agents chimiques dangereux décrites dans le Code du Travail [1].

Recommandations

La classification du BET en tant qu’agent mutagène sur les cellules germinales de catégorie 2, selon la réglementation CLP, n’impose pas les obligations réglementaires particulières aux agents chimique dangereux CMR de catégorie 1A et 1B [2]. Cependant certaines structures, institutions ou laboratoires ne font pas de distinction entre les différentes catégories de substances CMR, et cette démarche mérite d’être encouragée [3].

  • Privilégier l’achat et l’emploi de bromure d’éthidium sous forme de solutions aqueuses afin de limiter l’exposition aux poussières pouvant se disperser dans l’environnement de travail. Dans le cas contraire, la manipulation du solide (pesée, mise en solution…) devra s’effectuer en système clos ou sous ventilation (sorbonne, poste de pesée sécurisé) avec un masque à poussières si besoin.
  • Éviter tout contact du produit pur ou en solution avec la peau et les yeux. Utiliser des équipements de protection individuelle adaptés : blouse, gants de caoutchouc nitrile, lunettes de sécurité.
  • Respecter les règles d’hygiène dans les locaux.
  • Respecter les règles de sécurité vis-à-vis de l’utilisation des lumières ultraviolettes. Privilégier la lecture des gels d’ADN en système clos par caméra.
  • Stocker le bromure d’éthidium dans une zone ventilée à l’abri de la lumière, de la chaleur et de l’humidité. Il devra être stocké loin des substances oxydantes. Baliser la zone en indiquant la présence d’un agent mutagène. Seules les personnes autorisées devront avoir accès au stockage. Tenir à jour un registre.
  • Ne pas rejeter à l’égout ou dans le milieu naturel les eaux et les déchets (y compris lingettes, gants, eaux de lavages et résidus). Utiliser les techniques d’élimination et de décontamination décrites ci-après.
  • Décontaminer tout matériel qui aurait été en contact avec le BET et ses solutions aqueuses et devant subir un entretien ou une réparation (ex : transluminateur, bac d’électrophorèse, pipette…).
  • Former toute personne manipulant du bromure d’éthidium aux risques présents et aux moyens de prévention et protection existants.
  • Renseigner le plus fidèlement possible les fiches d’exposition.
Les substituants du BET
Des substances alternatives au bromure d’éthidium sont disponibles sur le marché. Certaines présentent l’avantage de détecter l’ADN ou l’ARN à des concentrations plus faibles ou de se révéler sans l’utilisation d’UV. Certains de ces colorants sont présentés comme « moins toxique, non cancérogène, non ou moins mutagène » par rapport au BET.

Aujourd’hui, aucune certitude n’existe sur l’absence de risque liée à la manipulation de ces substituants. En effet, ce sont tous des agents pouvant se lier aux molécules d’ADN et peuvent donc potentiellement perturber son utilisation normale par les systèmes cellulaires. En absence de preuves avérées de leur innocuité pour la santé humaine, les mesures de prévention et de précaution doivent donc être identiques à celles mise en place pour le BET.)

Techniques d’élimination et de nettoyage des surfaces souillées

Cette rubrique vise à informer sur les techniques existantes quant à l’élimination des déchets liquides contenant du BET et le nettoyage des surfaces suite à un déversement accidentel.

Oxydation par l’hypochlorite de sodium

L’hypochlorite de sodium, ou eau de Javel, est un agent de décontamination biologique couramment utilisé au laboratoire pour désinfecter surfaces et matériels mais aussi souvent utilisé à tort pour nettoyer des surfaces souillées par des agents chimiques. La méthode de décontamination du BET par l’hypochlorite de sodium est présentée par Armour [4]. Cette très controversée méthode n’est pas conseillée. L’hypochlorite de sodium est un agent qui, par oxydation, peut transformer des substances chimiques en substances réactives et donc toxiques. Quillardet et Hofnung [5] ont montré que les produits de dégradation du BET par l’hypochlorite de sodium possèdent, eux aussi, des propriétés mutagènes.

Dégradation par le permanganate de potassium en solution acide

Selon Quillardet et Hofnung, le permanganate de potassium (0,5 M) en solution d’acide chlorhydrique (2,5 M) oxyde le BET. Cette méthode est aussi controversée car les produits de réaction présenteraient eux aussi une activité mutagène (Lunn et Sansone [6]). En effet, comme l’hypochlorite de sodium, le permanganate de potassium est un agent oxydant.

Dégradation par action du nitrite de sodium et de l’acide hypophosphorique

De nombreux laboratoires préconisent cette technique de décontamination pour le traitement de surface ou de matériels souillés. Cette technique, décrite par Lunn et Sansone, utilise une solution aqueuse de nitrite de sodium et d’acide hypophosphorique. Elle conduit au remplacement partiel des amines primaires de la molécule de BET par l’oxygène. La méthode est aussi efficace pour traiter les solutions aqueuses contenant du BET : plus de 99,87 % de BET peut être éliminés. De plus, d’après les auteurs, les produits de réaction ne seraient pas mutagènes même si la méthode implique aussi l’utilisation d’un agent oxydant.

Cette méthode est adaptée aux surfaces et matériels pouvant être au contact de solutions corrosives (verre, acier inoxydable, formica, céramique, dalles de sols, filtres de transluminateurs…). Les substances et le mélange final sont corrosifs et toxiques, il convient donc de les manipuler en utilisant des équipements de protection collective (préparation sous hotte) et individuelle (blouse, gants nitrile, lunettes de protection) adéquats. En cas de nettoyage d’appareils électriques (table UV par exemple), ils devront être mis hors tension avant toute manipulation.

  • Préparer extemporanément une solution de décontamination contenant :
    - 4,2 g de nitrite de sodium (CAS no 7632-00-0),
    - 20 mL d’acide hypophosphorique à 50 % (CAS no 6303-21-5),
    - dans 300 mL d’eau.
  • Le pH du mélange doit être autour de 1,8.
  • Éponger les équipements et les surfaces contaminés avec une bande de papier absorbant imbibée de solution de décontamination.
  • Laver 5 fois de suite avec une bande de papier absorbant imbibée d’eau.
  • Les bandes utilisées sont placées dans un collecteur pour déchets chimiques dangereux, de même que les gants souillés. Dans le cas de la décontamination de matériels réutilisables, ils peuvent être immergés dans le mélange de décontamination au moins une heure sous hotte. La solution peut être ensuite amenée à pH compris entre 5 et 9 avec du bicarbonate de sodium avant de rincer le matériel 5 fois à l’eau. Le reste de solution est éliminé en déchets liquides dangereux.

L’efficacité de la décontamination peut être contrôlée en utilisant une lampe UV ou en mesurant la fluorescence des eaux de lavage, la procédure peut être répétée si besoin.

Cette méthode peut aussi être utilisée pour neutraliser des solutions aqueuses de BET. Dans ce cas, pour 100 mL de solution aqueuse contenant au maximum 0,5 mg/mL de BET, on ajoute 20 mL d’une solution d’acide phosphorique à 5 % et 12 mL d’une solution de nitrite de sodium à 0,5 M. Les solutions sont aussi préparées extemporanément. Après agitation brève, le mélange est laissé au repos sous hotte au moins 20 h. L’acidité du mélange est neutralisée avec du bicarbonate de sodium si besoin, avant élimination en déchets liquides dangereux. Dans le cas de matériels ne résistant pas aux solutions corrosives, un nettoyage à l’eau distillée peut être fait en remplacement de la solution de décontamination et suivi de 5 rinçages à l’eau.

Décontamination par absorption

Pour la décontamination de surface poreuse et des liquides, la résine absorbante polymérique non ionique Amberlite XAD-16 peut être utilisée, 1 g de résine absorbe environ 3,5 mg de BET. Il s’agit d’une résine commerciale disponible chez de nombreux fournisseurs de produits chimiques. La résine est hydratée de manière à former une pâte puis appliquée environ 1 h sur la surface à décontaminer. La surface est ensuite essuyée avec du papier absorbant. L’efficacité de la décontamination peut être contrôlée par dosage du BET dans les effluents. Enfin, tous les déchets solides sont éliminés en déchets chimiques dangereux. Cette résine ensachée est aussi efficace pour les solutions aqueuses contenant jusqu’à 500 µg/mL de BET.

Absorption des effluents contaminés sur charbon actif

  • Entonnoir et filtre charbon : Kit de filtration sur charbon (Schleicher and Schuell, VWR) gradué. Filtration de la solution au travers du filtre charbon. Élimination du filtrat à l’évier et du filtre en déchet solide dangereux.
  • Infusette : sachet d’élimination de 10 mg de bromure d’ethidium (MP Biomedicals). L’infusette est placé dans la solution de BET plusieurs heures. Élimination du filtrat à l’évier et de l’infusette en déchet solide dangereux. Infusette d'élimination de bromure d'ethidium (BET)
  • Colonne d’adsorption (Supelco (Amberchrom), Calbiochem…). Ces colonnes sont saturée à 300 mg et nécessitent un débit minimum de 200 mL/h.

Conduites à tenir en cas d’exposition au BET

En cas de projection dans l’œil :

  • laver aussitôt abondement à l’eau courante (rince-œil ou lave-yeux) en écartant bien les paupières et en prenant soin de ne pas contaminer l’autre œil ;
  • ne pas essayer d’enlever les lentilles de contact ;
  • consulter un ophtalmologiste.

En cas de projection sur la peau :

  • laver aussitôt à l’eau courante pendant 10 minutes sans frotter.

En cas de de blessures ou piqures avec du matériel souillé au BET :

  • laver aussitôt à l’eau courante pendant 15 minutes sans frotter ;
  • désinfecter avec de l’alcool éthylique 70 % (ne pas utiliser de Dakin®) ;
  • ne pas tenter de contrôler l’efficacité de la décontamination de la peau en s’exposant aux UV.

Dans tous les cas :

  • consulter en cabinet médical, aux urgences ou le service médical du lieu de travail ;
  • avertir l’assistant de prévention, le correspondant sécurité ou toute personne compétente ;
  • consigner l’accident/l’incident dans le registre d’hygiène et sécurité.
Qu’est-ce-que le BET ?
Le bromure d’éthidium (BET) est une substance chimique couramment utilisée dans les laboratoires de biologie moléculaire et cellulaire comme marqueur non radioactif des acides nucléiques. Il permet d’identifier et de visualiser des brins d’ADN ou d’ARN dans les électrophorèses et dans d’autres méthodes de séparation.
Centre de stockage des déchets ultimes Caractéristiques, toxicité et classification du bromure d’éthidium : le BET, utile mais toxique ?

Photo 1 : dépôt d’échantillons d’ADN de plantes sur un gel d’agarose permettant leur analyse. CNRS Photothèque/IBMP, Benoît Rajau. Photo 2 : nettoyage d’une surface souillée. Éric Menneteau, CNRS


[1] Code du Travail ; articles R4412-1 à R4412-93.

[2] Dans le cas d’agents CMR de catégorie 1A ou 1B (ex 1 et 2), le remplacement par un agent non dangereux ou moins dangereux est une obligation lorsque cela est techniquement possible. « Seul un argumentaire technique fondé est recevable pour justifier de la non-substitution d’un agent CMR » (Circulaire DRT no 12 du 24 mai 2006).

[3] La classification des agents CMR repose sur une notion d’incertitude et non sur la sévérité des dommages.

[4] Armour M.A., Laboratory methods for disposal of toxic inorganic and organic chemicals, Hazardous waste control in research and education, Korenga T. et al., Ed. Lewis Publisher, 1994.

[5] Quillardet P. et Hofnung M., Ethidium bromide and safety - readers suggest alternative solutions. Trends Genet., 4:89, 1988.

[6] Lunn G. et Sansone E.B., Destruction of hazardous chemicals in the laboratory. 2nd Ed. Wiley-Interscience publication, 1994